重組表達蛋白純化后為什么會發(fā)生沉淀?
重組表達蛋白純化后發(fā)生沉淀,這種情況一般發(fā)生在鎳離子親和純化蛋白中發(fā)生的最多,純化后的蛋白發(fā)生沉淀主要有這么幾種原因:
第一:在Ni純化的過程中,有一部分鎳離子會脫落,脫落的鎳離子屬于重金屬,會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用;
第二:我們?nèi)藶槿斯ぶ圃斓倪@種溶液環(huán)境,不一定真正符合蛋白本身的“生存”的環(huán)境要求,所以要從離子濃度和pH去考慮,特別是鹽離子濃度;
第三:找準蛋白質(zhì)的一個等電點,溶液環(huán)境的ph值不能在蛋白質(zhì)等電點的附近,如果在等電點的附近的時候,這個時候蛋白非常容易沉淀;
第四:蛋白反復凍溶,過程中生成的一些小冰晶會對這個蛋白的結構造成一定的傷害,離子和緩沖液狀態(tài)發(fā)生較大變化;
第五:如果長時間放在4度的情況之下蛋白質(zhì),容易滋生微生物,微生物的生長的可能造成蛋白的性質(zhì)變化或者降解也容易產(chǎn)生一些聚集沉淀。
是不是沉淀的蛋白就一定完全失去了結構活性呢?這個是不一定的,我們曾經(jīng)做過這樣一個案例,一個紅色熒光蛋白表達。放在4度放了一周,很多的蛋白都沉淀下來了,但是沉淀物依然是紅色的,這個案例說明了至少這個蛋白,蛋白質(zhì)沉淀后只是部分失活或者結構變性。如何避免和解決重組蛋白純化后聚集沉淀呢?
我們提出以下幾個建議:
1.我們建議如果用鎳柱來純化蛋白的時候,純化的過程純化之后的溶液當中適當?shù)募右稽cEDTA,讓它螯合脫落下來的鎳離子,減少重金屬對蛋白的傷害。
2.我們可以加點分散劑,避免蛋白質(zhì)分子接觸碰撞,減少它的聚集,這些分散劑,比如說甘油,聚乙二醇,甘露醇,還有這個山梨醇之類的。
3.我這個蛋白的話允許你加入一些輔助性的保護蛋白的話,那是最好比如說這個白蛋白。
4.可以加一點個氨基酸,比如說精氨酸。
5.準確的算出蛋白質(zhì)的pI等電點,算等電點是要把整個蛋白包括融合的部分都代入計算,包括載體上的人和蛋白,所以這樣才能算出一個準確的等電點,溶液的環(huán)境的pH值,要避免在等電點附近。
6.一個蛋白有些蛋白比較嬌貴,有些蛋白比較皮實,在這過程中的話,我們還要避免蛋白的一些熱損傷。
7.很多的蛋白的話,它獨立的時候是很難存在的,它必須有一些輔助的離子或者輔助的一些蛋白,它才能夠一個很好的維持一個很好的一個構象,所以必要的時候添加它的一些輔助的蛋白或者是因子。
8.每個蛋白的情況都不一樣,也許你在處理其他蛋白的時候都很好,但是處理這個蛋白的時候情況完全不一樣,這就是為什么呢?我們研究的這些蛋白,有時候沒有一招鮮或者是通用方案;我們曾遇過這樣的一個案例,某個寄生蟲體內(nèi)的一個酶,我們表達的時候,它可以得到上清表達非常好,我們對其中的一個氨基酸進行突變,它立馬從上清表達狀態(tài)變到包涵體表達狀態(tài);從這個地方我們是否可以通過加減氨基酸為蛋白質(zhì)”改命“(改性)。