談?wù)凜APS在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用
CAPS是,全稱3-(環(huán)己胺)-1-丙磺酸,一種有機(jī)化學(xué)物質(zhì),白色結(jié)晶粉末,CAS號1135-40-6,是一種生物緩沖劑,常用在生化診斷試劑盒、DNA/RNA提取試劑盒及PCR診斷試劑盒。用于酶化學(xué)及HPLC分離堿性藥物的緩沖液,在蛋白測序的轉(zhuǎn)膜過程中應(yīng)用廣泛。CAPS緩沖液由CAPS、去離子水組成,調(diào)PH到11.0,用于纖連蛋白的純化。
操作要點(diǎn):
1、SDS-PAGE電泳:按常規(guī)條件進(jìn)行(CAPS系統(tǒng):用于>=20KD蛋白;Tris-Tricine系統(tǒng):用于低分子量蛋白,也可用于高分子量蛋白);
2、甲醇濃度:CAPS電印跡緩沖液中甲醇濃度范圍是0-20%(甲醇濃度高,用于低分子量蛋白轉(zhuǎn)??;甲醇濃度低甚至不含甲醇的用于高分子量蛋白的轉(zhuǎn)??;
3、PVDF膜處理:取出PVDF膜,用甲醇浸泡數(shù)秒鐘,然后放入CAPS電印跡緩沖液中。(注:此后的操作須防止PVDF膜干涸。如果膜變干,須重復(fù)本步驟的操作);
4、凝膠處理:取出電泳凝膠,在CAPS緩沖液中浸泡5-10分鐘。(注:轉(zhuǎn)移某些強(qiáng)堿性蛋白pI>9.0時(shí),可省略本步驟);
5、安裝轉(zhuǎn)印槽子:將濾紙和海綿放入電印跡緩沖液中浸泡一下,然后按海綿、濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙、海綿的次序?qū)㈦娪≯E夾層裝好,并放入小型電轉(zhuǎn)槽中;
6、轉(zhuǎn)印條件:在50V恒壓條件下(100-170mA)于室溫下進(jìn)行電印跡轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移時(shí)間為0.5-2小時(shí)。(注:務(wù)必排盡凝膠和PVDF膜之間的氣泡。例如對70kD以上的蛋白質(zhì)須延長轉(zhuǎn)移時(shí)間);
7、PVDF膜染色前處理:取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗,用甲醇浸泡數(shù)秒鐘,然后進(jìn)行染色;
8、膜染色:考馬斯亮藍(lán)染色(將0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶于40%甲醇/1%乙酸中)30-50秒(切勿超過1分鐘),50%甲醇脫色(勤換脫色液),用去離子水充分洗滌,然后晾干即可.
CAPS緩沖液配制:
1、10xCAPS(100mmol/L)緩沖液配制,方法如下:CAPS,22.13g;加去離子水到900ml;用2mol/L NaOH(約20ml)將pH值調(diào)到11.0,然后定容到1L,貯存于4C。
2、CAPS電印跡緩沖液(含10%甲醇的1*CAPS)配制,方法如下:10xCAPS 200ml;加入甲醇200ml;加入去離子水1600ml即可。
其他應(yīng)用:
CAPS還是制造焊接材料、空調(diào)設(shè)備和制造的原料;還用于制造煙火:用作分析試劑、熱交換載體,也用于制藥工業(yè);用于空氣調(diào)節(jié)、煙火、干電池;也用作助焊劑、干燥劑;針對涂料行業(yè),用于水性異氫酸酯固化劑。